Western实验常用于定量或定性确定组织或细胞中蛋白质的表达情况。Western实验步骤比较繁琐，实验中的每一步细节都会对结果产生影响，今天，大博士就将多年来的实操经验分享给大家。

WB实验操作视频

蛋白质抽提→蛋白质定量→上样、电泳→转膜→封闭→孵育一抗→孵育二抗→化学发光方法检测

注：视频中以博士德CYP1B1（货号PB9546）多克隆抗体为例。

WB 实验产品清单  

WB 实验操作步骤

第一步：选择抗体

注意事项：

1. 蛋白是否有修饰；

2. 蛋白的表达情况；

3. 蛋白是否有可变剪接体；

4. 确定目的蛋白的分子量，选择合适浓度的凝胶。

第二步：蛋白提取

1.配置裂解液：预估样本总量准备裂解液。每1ml裂解液加入10ul的蛋白酶抑制剂和10ul的磷酸酶抑制剂 

2.贴壁细胞：用细胞刮，刮下细胞，将含有细胞的培养液转入离心管悬浮细胞：轻轻摇晃培养瓶，将含有细胞的培养液转入离心管

3.离心，3000rpm，3min

4.弃掉培养液，加入1ml 预冷的PBS洗涤液，漂洗两次，将含有细胞的洗涤液转入EP管，

离心，3000rpm，5min

5.弃掉洗涤液， 按照每10ul细胞沉淀加入100ul裂解液的比例加入裂解液，充分混匀，置于冰上裂解30-60min 

6.组织：取适量组织，称量，按照每0.1g的组织加入1ml裂解液的比例加入含有酶抑制剂的RIPA裂解液             

7.充分研磨 

8.将匀浆液转入离心管，冰上裂解30-60min  

9.超声破碎

10.离心，10000rpm，10min   

11.取上清 

注意事项：

1.实验过程中尽量让样本处于低温环境；

2.提取液避免不必要的成分，建议使用RIPA裂解液；

3.建议超声处理裂解后的蛋白样品，使蛋白定量更准确，蛋白条带更清晰，背景更干净（超声时间2秒，间歇2秒，功率100-200瓦）。

第三步：蛋白定量

1.制备标准曲线，加入代测样本

2.加入显色剂

3.37℃孵育30min 

4.酶标仪测定OD值

5.制作标准曲线，计算蛋白浓度

注意事项：

1.实验前蛋白定量必须做；

2.每次蛋白定量都要新鲜配置标准曲线；

3.选择定量前要了解每种方法的使用禁忌，比如BCA法禁止裂解液中有高浓度的还原剂和金属螯合剂。

第四步：蛋白变性

在样品中加入上样缓冲液，90-100℃沸水浴3-5min 

注意事项：

1.对于多重跨膜的蛋白，建议70℃加热10min；

2.变性蛋白在-20℃可保存至少2个月；

3.避免样本反复冻融；

4.加入一定体积的上样缓冲液，使各样本最终浓度保持一致，一般调至3mg/ml，上样量10ul。

第五步：凝胶制备

1.装好玻璃    

2.配制分离胶 

3.灌入分离胶，加水压平，水平静置30min 

4.凝胶聚合后，倒出蒸馏水，滤纸吸干

5.配制浓缩胶

6.灌入浓缩胶，插入梳子，水平静置30min

注意事项：

1.确保分离胶的PH8.4-8.8,浓缩胶的PH6.8；

2.过硫酸铵尽量新鲜配置；

3.凝胶需要缓慢凝固，否则会导致胶太硬造成烧胶；

4.TEMED有毒易挥发，尽量在通风橱中进行操作，根据温度适量增减，15-25℃按正常量加。

第六步：蛋白上样

1.装配电泳架

1. 倒入电泳液

2. 加入样品

注意事项：

1. 20-50μg/孔细胞，组织提取总蛋白，5-10ng/孔重组蛋白；

2. 尽量保持每个泳道的蛋白量一样，体积尽量一致；

3. 空置的泳道用等体积的上样缓冲液补齐。

第七步：蛋白电泳

1. 电压80V，开始电泳

2. 溴酚蓝跑到浓缩胶与分离胶交接处，调节电压至120V

3. 待溴酚蓝跑至凝胶底部0.5cm处，停止电泳  

注意事项：

1. 在时间允许的条件下，电泳时间不尽量慢一些；

2. 电泳液不建议重复使用；

3. 蛋白Marker并不是100%准确，一般有5%左右的误差。

第八步：蛋白转膜

1.制作转印夹：割胶，按照纤维垫-滤纸-凝胶-NC膜-滤纸-纤维垫依次放好 

2.将转印夹放入转印槽，倒入转膜液

3.转膜，150mA,70min

注意事项：

1.建议蛋白湿转；

2.大分子蛋白（大于200kd），可以将甲醇含量降到5-10%；

3.转膜结束后可以用丽春红检测转膜结果，单纯看Marker是否转到膜上来     判断成功与否并不准确；

4.恒流150mA/槽转膜，8%转80min，10%转70min，12%转50min。

第九步：封闭

1. 取出转好的NC膜，放入洗涤液中

2. 洗涤10min，重复3次

3. 倒掉洗涤液，加入封闭液，室温封闭90min

注意事项：

1. 建议使用实验级脱脂奶粉，一般的脱脂奶粉中的防腐剂会干扰抗原抗体的结合；

2. 封闭液最好是新鲜配置。

第十步：抗体孵育

1.倒掉封闭液，加入一抗

2.放入冰箱，4℃孵育过夜

注意事项：

1.建议使用专用抗体稀释液，有效减少一抗的非特异性结合，有效提升稀释后一抗的稳定保存时间；

2.建议过夜孵育抗体，抗原抗体反应更充分。

第十一步：洗涤

1. 倒掉一抗，洗涤10min，重复3次；

2. 倒掉洗涤液，加入二抗，室温孵育120min；

3. 倒掉二抗，洗涤10min，重复3次。

注意事项：

1. 建议使用TBS-T洗涤，对于某些抗体，TBS-T比PBS-T可以产生更强的信号；

2. 洗涤次数不宜过多，容易造成膜上蛋白丢失，也不宜过少，容易造成高背景，一般建议10min。

第十二步：检测

1. 将NC膜放入发光显色仪

2. 将配置好的发光底物覆盖NC膜

3. 化学发光成像仪，机器曝光成像

注意事项：

1. 化学发光法建议使用灵敏度高的发光液检测，可以尽量避免低丰度的蛋白出现假阴性；

2. 由于荧光法提供了多通道WB的可能性，可同时检测磷酸化蛋白和总蛋白，不用分子量的多种蛋白可同时检测，但要注意由于表位的重叠导致无法使用。

WB 实验常见问题

1.高背景

2.信号弱或无信号

3.非特异性条带

4.弥散型条带