敏感性加强型原位杂交检测试剂盒Ⅱ(AP)

Kit/1280

组分名称	规格	用途/用法	保存条件
胃蛋白酶(×10)	1ml	用蛋白酶稀释液按照1:10比例稀释	4℃可保存一年，应避免冷冻。
蛋白酶稀释液	12ml	为3%柠檬酸。用于稀释胃蛋白酶
预杂交液	2ml	探针杂交前的预杂交。即用型，直接滴加
探针稀释液	2ml	用于稀释探针
封闭液	5ml	抗体孵育前的封闭。即用型，直接滴加
生物素化鼠抗地高辛	5ml	生物素化鼠抗地高辛，即用型，直接滴加
SABC-AP	5ml	碱性磷酸酶标记的SABC。即用型，直接滴加
显色剂A(×20)	0.5ml	BCIP/NBT 显色剂A，需稀释20倍
显色剂B(×20)	0.5ml	BCIP/NBT 显色剂B，需稀释20倍
中性核固红	6ml	复染，即用型，直接滴加
水溶性封片剂	6ml	封片剂，即用型，直接滴加封片

该试剂盒适用于探针是地高辛标记的 mRNA杂交

原位杂交专用盖玻片；POLY-L-LYSINE；DEPC；20%甘油； 缓冲液(3%柠檬酸, 2×SSC(AR0058), 0.5×SSC, 0.2×SSC, 0.5M PBS(AR0033), 0.01MTBS(AR0031))

操作程序 一． 细胞和冰冻切片
准备工作：缓冲液的配备
3%柠檬酸——100ml蒸馏水中加柠檬酸（C6H8O7·H2O）3g,PH2.0左右。
2×SSC——1000ml蒸馏水中加氯化钠17.6g，柠檬酸三钠（C6H5O7Na3·2H2O，分子量294）8.8g。
0.5×SSC——300ml蒸馏水加100ml 2×SSC即可。
0.2×SSC——270ml蒸馏水加30ml 2×SSC即可。
20%甘油——20ml甘油加80ml蒸馏水即可。
0.5M PBS——1000ml 蒸馏水加氯化钠 30g，Na2HPO4·12H2O 6g，NaH2PO4·2H2O 0.4g，PH7.2-7.6。
0.01M TBS, PH7.2-7.6（AR0031博士德公司有售)(配法:1L双蒸馏水中加入8.5克氯化钠,1.2克Tris 和0.45—0.5ml纯乙酸。)
操作程序：
注意：最重要的是及时固定，并在固定液中加入0.1%的DEPC处理，以抑制RNA酶对mRNA的分解作用。此外，过度固定对原位杂交有明显的不利影响。
1．玻片的处理：一般采用多聚赖氨酸或APES。切片厚度10-20μm。
2．细胞在多聚赖氨酸处理的盖玻片上进行培养，条件为37℃和5%的CO2，所用培养基为Dulbecco基础培养基。细胞长好后0.5M PBS(PH7.4)洗2分钟×3次。
3．培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定：固定液为4%多聚甲醛，含有1/1000 DEPC。室温固定 20–30分钟。蒸馏水充分洗涤，干燥后-20℃冰冻可保存2周以上。
4．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶（1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀），37℃或室温消化5—120秒钟。有时也可以不消化。0.5M PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。
5．预杂交：湿盒的准备——干的杂交盒底部加20%甘油20ml以保持湿度。 按每张切片20μι加预杂交液。恒温箱37—40℃2—4小时。吸取多余液体，不洗。
6．杂交——用杂交稀释液 稀释地高辛标记的寡核苷酸探针，浓度一般0.5-2μg/ml。按每张切片加20μι杂交液。将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭掉后，盖在切片上。恒温箱37—40℃杂交过夜。
7．杂交后洗涤：去掉盖玻片，30—37℃左右水温的2×SSC洗涤5分钟×2次；0.5×SSC洗涤15分钟×1次；0.2×SSC洗涤15分钟×1次。必要时可重复0.2×SSC洗涤1次。
8．滴加封闭液：37℃30分钟。甩去多余液体，不洗。
9．滴加生物素化鼠抗地高辛： 37℃60分钟或室温120分钟。0.5M PBS洗5分钟×4次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
10．滴加SABC—AP：37℃30分钟。0.01M TBS洗5分钟×4次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
11．BCIP/NBT显色：BCIP/NBT （×20）按1：20的比例用0.01M TBS(PH9.2)稀释，混匀。显色液加至标本上。一般30—37℃显色20-30分钟。若无背景出现则可继续显色。充分水洗。
12．必要时核固红复染5-15分钟，水洗。
13．水溶性封片剂封片。
二．石蜡切片如果有条件的话，应尽可能地采用新鲜标本。标本离体后，及时予以固定。固定液为4%多聚甲醛，含有1/1000 DEPC。标本较大时用刀片切成厚度不超过4mm的小块，固定1小时即可，较大的标本固定不要超过2小时。某些组织对过度固定尤其敏感，如动物大脑，固定时间一定不要超过1小时。
1．常规脱水、浸蜡、包埋。切片厚度6-8μm。
2．玻片的处理：一般采用多聚赖氨酸或APES。
3．石蜡切片经常规脱蜡至水。
4．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶（1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀），37℃或室温消化3–30分钟（视标本新旧、厚薄自行调整）。用户可以比较不同的消化时间，例如10分钟，20分钟，30分钟，以找到最佳的消化时间。0.5M PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。
其余步骤和冰冻切片6-13步相同。
结果观察：阳性细胞胞浆着色呈紫蓝色。
注意事项：如果有少量的细胞核着色属于正常情况；如果出现大量的细胞核着色，往往和标本固定时间过长有关，应重新处理标本。有其它明显的非特异性染色现象时，可以用预杂交液对含探针的杂交液进行稀释，一般稀释2—5倍。

4°C保存一年

1. 注意低温保存，避免污染；
2. 使用时穿戴好实验服和一次性手套;

敏感性加强型原位杂交检测试剂盒Ⅱ(AP) (Boster Biological Technology, Wuhan, China. Catalog#MK1032)